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正確認識小肽產品

正確認識小肽產品(一)
台灣美農興業股份有限公司
 
    蛋白質是所有動物生命活動最重要的物質,動物體內所有的代謝及健康的調節和保障都需要蛋白質。蛋白質必須由其前體物轉化而來,前體物的優劣會影響蛋白質轉化的效率及品質。
    提高蛋白質的利用效率是緩解蛋白質短缺最重要的途徑之一。利用效率是指整體效能,是蛋白質各種表達效果的總和,不僅僅是吸收利用率。
 
現有蛋白原料的優缺點剖析
(一) 動物性蛋白原料
    優點:蛋白含量、胺基酸含量相對較高,胺基酸的含量平衡對動物而言相對合理;蛋白質胺基酸的利用率相對較高。
    缺點:品質(營養品質)的穩定性最差;穩定性的波動很難監控;含有的有毒有害物質是不可控制和難監測的,尤其是自配戶本身無品管設備,故單憑進出口時的檢驗報告是很難對購買的動物性蛋白原料做監控,它們對動物的危害是最大的。動物性蛋白資源短缺是未來必需面對的問題。
 
魚粉
    魚粉由於資源短缺,品質參差情況嚴重,還有魚粉本身的危害例如骨刺(消化道損傷)、本身含有的脂肪氧化產生有毒有害的物質(脂肪氧化)及糜爛素&沙門氏菌汙染問題,都是魚粉的缺點。重點是自配戶無法對購買之魚粉做適當的品管。
血漿蛋白
    血漿蛋白是一種優質的動物蛋白,其缺點在於效果過分誇大,它們的作用僅僅在於是一個優質蛋白。因為依據豬的生理消化特點,只有在出生後的前三天才能吸收完整的免疫球蛋白,免疫球蛋白必須以完整的蛋白形式才能起作用。實際上根據消化機制,豬已經失去吸收完整蛋白的能力。
肉骨粉
    肉骨粉裡蛋白質的含量是最不可控的,不同程度的含有動物幾乎不能消化的角蛋白;骨的危害與魚粉類似,會引起消化道的物理損傷;本身的營養品質不高(蛋白質、胺基酸的利用率不高,胺基酸不平衡,色胺酸嚴重缺乏);肉骨粉是動物飼料原料裡面氧化脂肪、病原菌含量最難控制的原料之一。
 
腸黏膜蛋白
    宣傳和固有的性能是兩碼事,現有的腸黏膜蛋白事實上用腸組織而不是腸黏膜粉碎而成;含有的病原類物質是不可控的,用量大以後易引發各種問題。
 
(二) 植物性蛋白原料
大豆濃縮蛋白:
    缺點:含有的抗營養因素比豆粕低,但不能徹底消除,不良寡醣及凝集素更難消除;由於它的加工的不確定性,抗營養因子的含量存在著較大的波動性;它還含有一部分球蛋白,對消化道是一種異源蛋白,會引起消化道過敏性反應和損傷,同時也會引起腹瀉;蛋胺酸含量低;有效期較短。
 
發酵豆粕
    發酵豆粕產品所標榜具有小肽功能往往是言過其實。我們知道大豆是一個很好的蛋白質來源,但大豆中含有多種抗營養因子,包括胰蛋白酶抑制因子(trypsin Inhibitor)、血球凝集素(Lectins/hemagglutinins)、大豆球蛋白(glycinine)、大豆聚球蛋白(β-conglycinine)、甲狀腺腫誘發因子(Goitrogen)、抗維生素因子(anti-Vitamine)、植酸鹽(Phytase)、尿素酶(Urease)、皂苷(Saponin)、寡醣(Oligosaccharides)和胃腸脹氣因子(S & I-flatulence factor)等抗營養因子(Anti-nutritional factors)。發酵豆粕是利用發酵原理使用微生物及部分酵素,讓大豆抗原、抗營養因子及毒素部份大量被清除,進而提供菌體蛋白、提高消化利用率及大豆蛋白質細小化的多肽(polypeptides)產品,是一種低抗原及有利於動物消化吸收的大豆蛋白質的產品。缺點:雜菌感染(發酵的溫度條件亦適宜於雜菌的生長繁殖;生產條件參差不齊);固體發酵的品質可控性和不同批次產品的品質同一性較差;對蛋白質的改變較少,仍以大分子蛋白為主,不是真正的小肽產品。
 
小肽的營養作用
    傳統營養學認為,動物採食的日糧蛋白質在消化道內經蛋白酶和肽酶的作用降解為小肽和游離基酸,游基酸可以被動物直接利用,而小肽只有進一步降解為基酸才能被利用。但隨後研究表明,蛋白質在消化道的降解產物大部分是小肽(主要是二肽和三肽),他們以完整形式被吸收進入循環系統而被組織利用。進一步研究發現,與游離基酸相比,小肽吸收具有吸收快、耗能低、吸收率高等優勢。小肽的吸收機制與游離胺基酸完全不同,與游離胺基酸相比較,小肽的吸收屬細胞間微孔吸收,是一種高吸收 (per—sorption)。二者在動物體內具有相互獨立的吸收機制,互不干擾,這就有助於減輕由於游離基酸間相互競爭共同的吸收位點而產生的吸收抑制作用,有利於蛋白質的利用。小肽(SP)一般是指由2至6個胺基酸組成的寡肽(Oligopeptide),可直接被消化道吸收進入循環系統,被組織代謝利用,與游離胺基酸比較,小肽是優良的蛋白質前體物,它的營養優勢主要表現在以下幾個方面:
 
壹、                加快蛋白質合成 -- 近年來的研究表明,日糧胺基酸的供給形式影響動物對蛋白質的代謝。血液迴圈中的小肽能直接參與組織蛋白質的合成,此外肝臟、腎臟、皮膚和其他組織也能完整地利用小肽(Pierzynowski等,1997),其中腎臟是消化吸收肽和再捕獲胺基酸的主要場所(Adibi,1997)。Zaloga(1991)研究表明,以寡肽形式作為氮源時,整體蛋白質沉積率高於相應胺基酸日糧或完整胺基酸日糧。Fnabiki(1990)研究表明,分別用含小肽和游離胺基酸(FAA)日糧飼餵小鼠,含小肽日糧組小鼠體蛋白合成效率比含FAA組高26%。雛雞在灌注小肽後,組織蛋白質合成率顯著高於游離胺基酸組。其原因可能是:(一)食入的氮源以小肽形式吸收時,由於可避免掉游離胺基酸在吸收時的競爭,因此吸收率更高,合成蛋白質的效率也隨之升高;(二)蛋白質合成受多種激素調控,而某些小肽具有激素樣作用或可刺激激素產生;(三)蛋白質合成率與動靜脈胺基酸差存在相關性(Boiclair,1993),在吸收狀態下,其差值越大蛋白質的合成率越高,由於小肽的吸收速度快、吸收峰高,因此能快速提高動靜脈的胺基酸差值,從而提高蛋白質合成效率。
 
貳、                提高礦物元素的吸收利用率 -- 小肽可與鈣、鋅、銅、鐵等礦物離子形成螯合物增加其可溶性,以利動物體的吸收。Fouad(1974)指出,位於五元或六元環絡合物中心的金屬離子可通過小腸絨毛刷狀緣,以小肽形式被吸收。在動物小腸內能與鈣結合而阻止磷酸鈣沉澱的形成,使腸道內溶解鈣的量大大增加,從而促進鈣的吸收和利用。施用暉等(1996)研究證明,在蛋雞日糧中添加小肽製品後,血漿中鐵、鋅含量顯著高於對照組,蛋殼強度提高。
參、                提高動物機體免疫力 --  小肽能夠加強動物消化道內有益菌群的繁殖,提高菌體蛋白的合成,同時小肽可以提高動物自身免疫力,增強抗病力。三肽和六肽可促進巨噬細胞的吞噬作用。某些活性小肽能令幼小動物的小腸提早成熟,並刺激消化酶分泌,提高機體免疫能力。
肆、                生理調節作用 -- 近年來的研究表明,小肽可以直接作為神經遞質刺激腸道受體激素或酶的分泌而發揮作用。對瘤胃微生物的作用--小肽是反芻動物瘤胃微生物蛋白質合成的重要底物(Armstead等,1993)。小肽對瘤胃微生物生長的主要效應是加快微生物的繁殖速度,縮短細胞分裂週期(Maeng等,1976)。雖然目前還不完全清楚瘤胃微生物對小肽轉運和利用的機制,但已證明小肽是瘤胃微生物達到最大生長效率的關鍵因素,小肽促進微生物生長主要取決於作為能源的碳水化合物的發酵速度。
 
 
小肽的生產方法
     小肽生產的關鍵是成本降低到可以被用戶所接受。常用的小肽生產方法主要有:化學合成、酶法分解(提取)和重組DNA技術。
甲、化學合成 -- 發展較早,技術成熟,已廣泛應用於生產高價值的藥用肽,有固相與液相兩種方式,操作雖然不同,但原理基本一樣。該方法缺點是,整體生產效率低,生產中使用大量的有毒溶劑,對環境和健康有害且成本很高。
乙、DNA重組法 -- 此法避免了化學合成法的缺點,但在基因表達和回收上存在問題,並且生產小肽的種類受限制,不能生產醯胺肽,也不適合製備短鏈肽。
丙、酶法分解(萃取)-- 用此法較適宜生產小肽,成本相對較低,所用基質、反應劑、反應條件無害。主要缺點是缺乏合適的蛋白酶,產率低。現在飼用小肽產品主要是應用此法生產。
 
小肽的應用
小肽產品可應用到各種畜禽及水生動物飼料中,具有促進動物生長、提高生產性能、改善產品品質和動物健康狀態的作用。在蛋雞日糧中添加小肽製品後,蛋雞的產蛋率、飼料轉化率顯著提高,蛋殼強度有提高的傾向。Parisini等(1989)在生長豬日糧中添加少量小肽後,顯著提高了豬的日增重、蛋白質的利用率和飼料轉化率。在肥育豬飼料中添加合成小肽能提高產肉率和瘦肉率(Lootekhniga等,1994)。有試驗表明,小肽可改善泌乳母豬的生產性能,使其泌乳量增加,重配更快、更容易。Cahu等(1995)報導,在日糧中添加小肽後,能提高金魚和海鱸魚的存活率。Znfante等(1997)報導,用小肽製品代替部分鱸魚魚苗日糧中的蛋白質後,魚苗的生長速度和存活率提高。(後續將有詳細說明)
 
小肽的檢測方法
目前飼料用小肽產品的檢測方是大致如下:
 
一.關於小肽產品中小肽含量的確定:
1.1 檢測方法:三氯乙酸氮溶指數(TCA—NSI)
1.2 原理:
三氯乙酸是一種蛋白質沈澱劑,它可以沈澱蛋白質和較長的肽段。隨著酶解反應的進行,蛋白質的肽鏈逐漸被切成大小不等的片段,三氯乙酸氮溶指數提高。因此,三氯乙酸氮溶指數可以準確地反應蛋白質的酶解情況,溶解指數越高,表明小肽的含量越高。
1.3 方法:
肽含量檢測方法—三氯乙酸氮溶指數(TCA-NSI)
檢測專案
檢測方法
 
一.        儀器設備
1. 實驗室用樣品粉碎機或研缽      2. 分析篩:孔徑0.45mm(40目)
3. 分析天平:感量0.0001g         4. 消煮爐或電爐
5. 滴定管:酸式,10、25mL       6. 消煮管:250mL。
7. 凱氏燒瓶:250mL               8.離心管
9.凱氏蒸餾裝置:半微量凱氏定氮裝置
10. 錐形瓶:150、250mL           11.容量瓶:100mL
12.燒杯:250 mL                
13.臺式離心機:定時,調速,轉速可達4000 轉/分
14. 普通磁力攪拌器               15. 移液管:25 mL
16.稱樣皿:
17.電熱式恆溫烘箱:可控制溫度為105±2 ℃
二.        試劑
   1. 硫酸:化學純,含量為98%,無氮;
2.混合催化劑:0.4g 五水硫酸銅,6g硫酸鉀,均為化學純,磨碎混勻;
3.氫氧化鈉:化學純,40%水溶液(m/V);
4.硼酸(GB 628):化學純,4%水溶液(m/V);
5.混合指示劑:甲基紅0.1%乙醇溶液,溴甲酚綠0.5%乙醇溶液,兩溶液等體積混合;
6.鹽酸標準溶液:鄰苯二甲酸氫鉀法標定,按GB 601製備;
   鹽酸標準溶液:C(HCl)=0.02mol/L。1.67mL鹽酸(GB622,分析純),注入1000mL蒸餾水中
7.硫酸銨:分析純,乾燥;
8.三氯乙酸:分析純,10%水溶液(m/V)。
9.蔗糖(HG3-1001):分析純
 
 
 
三.        操作方法
取稱樣皿一隻, 250mL燒杯一隻,離心試管六隻,洗淨後置於烘箱中備用。
粉碎研磨,全部過40目篩,取篩下物約5克置於稱樣皿中,在105℃的溫度下烘乾3h,取出,蓋好稱樣皿蓋,在乾燥器中冷卻30min,稱重。再同樣烘乾1h, 冷卻,稱重,直至兩次重量之差小於0.002g為恆重。
稱取恆重後的樣品m1克(註:樣品約2至3克),置於燒杯中,加蒸餾水75mL,室溫下電磁攪拌45分鐘。將燒杯中溶液及沈澱搖勻,折入離心試管中,離心後收集上清液(1號上清液)。
 註:離心轉速2500轉/分鐘,離心時間10分鐘。
4.取1號上清液25mL,加入25mL10%的三氯乙酸溶液,混合後靜置20分鐘。將燒杯中溶液及沈澱搖勻,折入離心試管中,離心後收集上清液(2號上清液)。
 註:離心轉速4000轉/分鐘,離心時間20分鐘。
5.取2號上清液25mL,小心移入乾燥的500mL凱氏燒瓶中,加入混合催化劑6.4g,再加入12mL濃硫酸和數粒玻璃珠,搖勻,將凱氏燒瓶置於電爐上加熱,開始小火,待樣品焦化、泡沫消失後,再加強火力,直至呈透明的藍綠色,然後繼續加熱,至少2h.。待試樣消煮液冷卻,加入20mL蒸餾水,轉人100mL容量瓶中,冷卻後用水稀釋至刻度,搖勻,做為試樣分解液。安裝好半微量蒸餾裝置後, 向接收瓶內加入20mL硼酸吸收液及2滴混合指示劑,並使冷凝管下端插入吸收液內,蒸汽發生器的水中應加入甲基紅指示劑數滴,硫酸數滴,在蒸餾過程中保持此液為橙紅色,否則需補加硫酸。準確移取試樣分解液10mL注人蒸餾裝置的反應室中,用少量蒸餾水沖洗進樣入口,塞好入口玻璃塞,再加10mL氫氧化鈉溶液,小心提起玻璃塞使之流入反應室,將玻璃塞塞好,且在入口處加入密封,防止漏氣。蒸餾5min降下錐形瓶使冷凝管末端離開吸收液面,再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均流入錐形瓶內,然後停止蒸餾。
6.蒸餾後的吸收液立即用0.02mol/L鹽酸標準溶液滴定,溶液由藍綠色變成灰紅色為終點。得消耗鹽酸標液V1(mL),滴定的結果用空白實驗校正。
7.另稱取樣品m2克(約0.5至1克),用步驟5相同的方法定氮,得消耗鹽酸標液V2(mL),滴定的結果用空白實驗校正。
 
 
 
 
 
四.計算公式
1.三氯乙酸氮溶指數(TCA-NSI)按式(1)計算:
TCA-NSI(%)=((V1-V0)×m2×75)/((V2-V0)×m1×12.5) ×100 ……(1)
式中:m1---測定可溶性氮時稱取的試樣質量,g;
m2---測定總氮時稱取的試樣質量,g;
      V0---空白試驗消耗的鹽酸標準滴定溶液體積,mL;
      V1---測定可溶性氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積,mL;
V2---測定總氮時消耗的鹽酸標準滴定溶液體積,mL;
 
2.允許誤差
   每個試樣取兩平行樣進行測定,以算術平均值為結果。兩次平行測定結果絕對差值不大於3%。
 
 
1.4 富力肽中小肽含量的確定:
採用上述方法進行檢測,可以確定產品中的小肽含量。
例如在某產品中的全部蛋白類物質中小肽的含量為≧65%。
在某產品中的水溶性蛋白類物質中小肽的含量為≧98%。
 
. 關於富力肽產品中小肽分子量譜的確定:
2.1 檢測方法:基質輔助鐳射解吸附飛行時間質譜
(MALDI-TOF-Mass Spectroscopy)
2.2 原理:
質譜是肽和蛋白質分析的重要工具,這主要歸功於一些軟電離技術的應用,其中最具代表性的即基質輔助鐳射解吸附電離(MALDI)。該項技術由於方便、靈敏度高,已成為蛋白質酶解產物中肽段質量譜分析(Peptide Mass Fingerprinting)的最有效的工具。
MALDI-TOF-MS採用有紫外吸收的小分子晶體為基質,將待測物與基質結合。然後用一定波長的鐳射照射,聚集的能量加熱晶體,使基質晶體昇華而將非揮發性的待測物釋放到氣相中。MALDI主要生成待測物的單電荷離子,送入TOF(Time of Flight)分析儀,測得離子從起始譜到探測端的飛行時間,根據飛行時間的長短確定分子量的大小,從而得到一張完整的蛋白質酶解產物的肽段分子量圖譜。
2.3 富力肽產品中小肽分子量的確定:
MALDI—TOF—MS的檢測結果表明,在某產品中的水溶性蛋白類物質中,富含2~6個胺基酸的小肽。肽段的分子量區間為:
 
    分子量(Dalton;道爾頓) 摩爾百分含量
     0~160                        3%
    161~650                      87%
    651~1000                      8%
     > 1000                       2%
 
 
 
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